qpcr复孔误差和平行实验误差,qpcr内参不齐能比较吗

qpcr三个复孔结果不一样 2023-10-13 10:49 861 墨鱼

qpcr三个复孔结果不一样

qpcr复孔误差和平行实验误差,qpcr内参不齐能比较吗

我一般先加模板，然后加引物，最后加mix,每个孔pipette10来次，然后简单转一下，去掉气泡(这步也不是很必要),平行的空，大部分小数点后一位到两位的误差是正常的zhy平平(2015-9-可以，但不要告诉导师

rt,用的八连管做qpcr,连续做了4次96孔的，每次都有许多复孔的cq值差别大于1,明天就要交数据了，看到复孔的差异真的睡不着！自己想不太通，推测以下原因： 1.每孔加2ul的cDNA,cDNA用之qpcr实验每次平行的扩增曲线都相差很大，怎么解决？用的是SYBR染色方法；1.保证样品融化完全，混匀，且用同一个白枪尖上样。2.保证qpcrmix和引物及水混匀良好。3.

∪▂∪ 1.加样误差大。2.试剂和体系未混匀。3.样品拷贝数低。4.没有使用Rox校准。【解决方案】1.校准移液器。2.试剂彻底混匀，配制体系彻底混匀。3.模板浓度低，重复性差，复孔将得到的标准曲线进行引物扩增效率的计算：以Vazyme #Q711的荧光定量Mix扩增某基因为例：①qPCR扩增：将qPCR产物进行原液、1/10、1/100梯度稀释，每个梯度设置三个复孔，进行qP

再混匀。我自己在开始做qPCR的时候复孔差距很大，排查了很多原因发现是进样细节有误差。希望对你有帮助9.复孔重复性差1)加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。2)模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。3)仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校

可能原因：加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不佳；PCR 酶灵敏度不高及活力下降。解决方案：标准品加样体积大于2ul、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选4、qPCR试剂的选择：选择“预混液”形式的qPCR试剂，反应体系只需加入引物和模板，大大简化实验的操作步骤，减少了加样误差。好了，读到这里，您应该不会再用纠结复孔平台期荧光信号不

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