PCR反应的产物比例,pcr扩增实验中各试剂的作用

PCR反应的产物比例,pcr扩增实验中各试剂的作用

ˋωˊ 其原理：随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs):这些作为合成DNA新链的构件，包括四种基本的DNA核苷酸(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。dNTPs通常以等摩尔量添加到PCR反应中，以实现最佳的碱基结合。PCR缓冲液

?＾? 循环次数过多，会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后，反应中Taq DNA 聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA 样品稀释1000-PCR产物量可用P=N×(1+E)n计算。P代表PCR产物的拷贝数，E代表平均每个热循环的PCR扩增效率，N代表起始模板拷贝数，n代表热循环次数。平均扩增效率理论值为100%,但在实际反应中平均效率

●△● PCR时，管壁尽量避免写字。管盖一定要盖严。10μL逆转录反应体系建议加入不超过500ng的RNA。如果目的Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会

但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过0.010–0.015 mM(其估计Km值)(图4)。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度( 0.01PCR产物每个循环增加一倍，最终扩增可达10倍。PCR扩增的原理是DNA双链复制，基因呈指数式增长。在PCR反应中，经过n

⊙﹏⊙ 2. PCR产物量过少(1) 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。2) DNA模板量太少。增加DNA模板量。3) PCR循环数不足。增加反应循环数。1、变性温度和时间：模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。适宜的变性条件是95℃ 30s或97℃15s。变性不完全，DNA双链会很快复性因而减少产量。在变性中温度太高或反应时间过长会导致