稳转筛选,稳转是过表达吗

稳转筛选,稳转是过表达吗

Day3-4：每隔一天更换含嘌呤霉素的培养基，嘌呤霉素的筛选至少需要48 h（一般能杀死90%以上的细胞），有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2～10天。制作杀死曲线先感染Cas9慢病毒，参照《慢病毒感染手册》选择MOI在70-80%的病毒剂量进行Cas9慢病毒稳转株的构建，经合适浓度的Puromycin抗药性筛选，得到稳定表达Cas9的混合克隆细胞株(待荧光为100%后将puromycin

● 潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化，推荐使用浓度为50-1000 μg/mL。对于第一次使用的实验体系建议通过建立杀灭曲线(ki稳转株筛选48h 加入选择性抗生素进行稳转株筛选，预实验确定抗生素的杀伤浓度(在规定时间内，将细胞全部杀死的最低浓度).  提前一天接种细胞与24 孔板中，待第二天长成25%

一般来说，稳转株建立包括转染载体转染、筛选和稳定性验证等步骤。转染载体转染是将转染载体转染到细胞内的过程，可以通过质粒转染、质粒融合、质粒导入、病毒感染等方法来实1. 稳转细胞系稳定感染就是慢病毒携带的外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时感染基础上对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所

①对感染并筛选后的混合克隆稳转株进行消化后接种于96孔板中，每孔一个细胞(可通过倍比稀释或或者流式分选等方法); ②标记出具有单个细胞的孔等细胞扩增后用抗性基因进行筛选；③培稳转株筛选48h加入选择性抗生素进行稳转株筛选，预实验确定抗生素的杀伤浓度(在规定时间内，将细胞全部杀死的最低浓度)。 提前一天接种细胞与24 孔板中，待第二天长成

常见的抗性筛选标记1嘌呤霉素嘌呤霉素是通过提前链终止，起到抑制蛋白合成的作用。但在嘌呤霉素-N-乙酰转移酶作用下，嘌呤霉素乙酰化而失活。嘌呤霉素盐酸盐用来筛选稳转株的工作这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带