wb检测不到his标签,为什么WB显出来有一个没条带

FLAG标签的WB结果 2023-06-03 21:38 897 墨鱼

FLAG标签的WB结果

wb检测不到his标签,为什么WB显出来有一个没条带

上清的蛋白挺多的，第一次过柱液(L1)指的是第一次过柱后的流出液，原则上该流出液应该用WB检测不到his蛋白的表达，但是我做的结果是能检测到his蛋白，说明我的his蛋白在第一步就可能原因：HIS标签丢失，策略1:WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位置(C-terminal or N-terminal),必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2:孵育的时间不够，降低流速和增

＞０＜ Q:克隆方案中His标签放在N端还是C端好？A: 如果您表达的蛋白大小适中，且后续不需要切除标签，N端或者C端都可以；如果您表达的蛋白较小，建议放在C端，可以缓解蛋白降解；如果您后His标签没有表达或丢失或暴露不充分。建议1 用anti-His的抗体进行WB,检测His标签是否存在。建议2 将蛋白用4-6M盐酸胍或4-8M尿素变性后，让His标签充分暴露出来，看是否能与填料结合。

ˋ▂ˊ 使用WB在细胞裂解液中筛选his标记的蛋白从细胞裂解物中筛选his标记的重组蛋白(构建)是抗his标签抗体的一种流行应用。Anti-His Tag抗体允许检测羧基端和氨基端his标记蛋白。图1展示了d)可能原因：His标签丢失解决方法1:WB 检查His 是否表达，上游构建，改变His-tag 的位置(C-端或N-端),必要时增加His个数。解决方法2:孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。解决方法3:改变螯

答：若目的His 标签蛋白正常表达(使用抗His 标签的抗体进行WB 检测)且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱：若His 标签蛋白流穿： •样品或结合缓在GST pulldown实验中，用GST融合蛋白共纯化His融合蛋白，后做WB检测His融合蛋白，用His－tag Antibody

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