qpcr复孔数据不一致,qpcr复孔重复性总是做不好

qpcr复孔数据不一致,qpcr复孔重复性总是做不好

9.复孔重复性差1)加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。2)模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。3)仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校目前正做qpcr,引物特异性没有问题，目前就是副孔，重复ct值相差太大，相求助战友们就我而言，我现在

ˇ＾ˇ 可能原因：加样误差；标准品降解；模板浓度高或有抑制物；引物或探针不佳；PCR 酶灵敏度不高及活力下降。解决方案：标准品加样体积大于2ul、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选综上：数据的有效性和复孔平台期荧光信号关系不大，主要与复孔间的△Ct有关，MIQE标准是△Ct<0.5。在复孔△Ct<0.5的情况下，复孔平台期不同并不影响实验结果，但是有没有办法可以让复

复孔间重复性差一般会有以下两种情况：(1)CT 值很大，如CT≥ 30,重复性差属于正常现象。该现象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情况下，模板与引物的碰撞存在随机性，直接导致复孔间的CT 值差异5)排除了以上所有可能后，结果还不一致的话，先检查QPCR结果是否正确。比如只是挑了一个基因的话，如果你确定QPCR没有问题的，那就以他为准。如果你挑了20个基因，结果都不一致的

做完转录组测序之后，往往会用QPCR来验证一下结果。但验证结果往往会出现基因表达的上下调趋势不一致的问题。我们先来分析一下两者不一致的原因有哪些。1、原因可能有：1)样品对比关系搞反了(AvsB其实，在qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异。例如：PCR 反应板本底信号不均一，PCR 管盖厚度有差异，同一反应体系在分装时出现了差异等因素。ROX™ 能帮助

第一点，你基本不会用移液器做PCR检测！移液枪，尤其是微量移液枪，长时间操作的速度非常快，也就是说，弹簧没有来得及恢复，又再次按下去，极易对你的拇指关节造成损伤。好吧，这都是其次复孔差异大可能是因为上样前吹打不匀或者不同枪头存在差异，建议充分混匀后同一枪头加样(包括内参+目的)。另外，30以上的目的基因本身表达量较低，更容易出现复孔差异大的现象，不确定就